蛋白质印迹（WB）成功指南

蛋白质印迹法也称作免疫印迹法，是一种广泛应用并公认的技术，用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。这项技术通过抗体与 特异性目的蛋白结合，测量生物样品中的蛋白质水平。抗体与其靶标蛋白表位之间发生的精确结合作用允许检测蛋白质内部高度特异的 氨基酸序列。抗体也可检测蛋白质上的特异性翻译后修饰（PTM）。磷酸化特异性抗体已用于鉴定特定信号通路中的靶标以及用于研究 各种生物学背景下磷酸化过程的改变。最近出现了针对其他类型 PTM 的特异性抗体，从而允许研究人员监测蛋白质的乙酰化、甲基化 或泛素化状态改变。

Cell Signaling Technology（CST）的科学家每天会进行一千多次蛋白质印迹实验，以验证我们现有的抗体和新的抗体。您可在本指 南末尾找到二十多年来我们不断优化的蛋白质印迹法实验步骤，它也可以在线查看，从而您可以重复这个过程并得到可复制且可靠的 结果。

在此，我们将着重介绍蛋白质印迹实验步骤中的关键步骤，并展示实验步骤的改变可能对您的实验结果产生的影响。我们还将讨论在您 的蛋白质印迹实验中使用已充分验证抗体的重要性。最后，我们将为您展示 CST 科学家们使用的且与我公司抗体搭配使用表现最佳的 常用试剂清单。

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免疫沉淀（IP）成功指南

免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）是一种免疫检测技术，它利用抗原与抗体之间的特异性反应，从不均一的细胞或组织提取物中富集特定蛋白质。在免疫沉淀过程中，特异性识别目的蛋白（抗原）的抗体被用来捕获这种蛋白质，目的蛋白被捕获后，通过添加如 Protein A 或 G 微珠等亲和层析介质来沉淀抗原-抗体复合物，然后通过洗涤以去除未结合的物质，获得富集后的蛋白。最后，可以使用 Western Blotting（WB）、质谱分析等方法来鉴定和分析所获得的目标蛋白质。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）则通过富集天然状态下的蛋白质复合物来研究蛋白质-蛋白质相互作用。一种蛋白质（称为“诱饵”）是免疫沉淀的目标，复合物中的另一种蛋白质（称为“猎物”）被用于下游分析。免疫共沉淀实验是在非变性条件下进行的，以保持蛋白质复合物的完整性。

免疫（共）沉淀实验常用于研究蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质翻译后修饰以及蛋白质复合体组成等，是生物化学和分子生物学研究中的重要工具。

本手册将着重介绍免疫沉淀搭配下游 WB 检测的实验流程中的关键步骤，我们还将讨论在免疫沉淀实验中选择经过充分验证的抗体的重要性。最后，我们会提供 CST 科学家们使用的且与 CST 抗体搭配使用表现最佳的常用辅助试剂清单。

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免疫荧光（IF）成功指南

免疫荧光(IF)将抗体识别与荧光成像技术相结合，以直观观察固定细胞或组织样本中的靶标蛋白和其它生物分子。通过这一过程可以揭示 靶标蛋白的定位、相对表达以及是否处于激活状态。IF 的强大之处在于能同时提供图像化，可量化的数据。

进行 IF 实验时，可以使用与荧光团偶联的一抗（直接检测）或使用未标记的一抗，然后使用荧光团偶联的二抗（间接检测）的两步法来检测 感兴趣的蛋白质。通过任一种方法，用户都可以结合多种荧光基团（多重分析），使得 IF 成为研究蛋白共定位、亚细胞定位变化、细胞内蛋 白的不同激活状态、识别不同的细胞亚群及开展其它分析的理想方法。

Cell Signaling Technology(CST) 致力于提供既能生成强大特异性信号、同时又尽可能降低背景的高特异性抗体。我们的科学家筛选了 大量的抗体，只推荐其中最适合相关应用的抗体。我们的验证工作包括完善的实验步骤优化和抗体浓度滴定，以确定每种抗体发挥作用的 最佳条件。除此之外，我们的科学家还验证了各种辅助试剂，比如荧光基团偶联的二抗，以增强抗原检测并提高 IF 实验的效率。

本应用指南将重点阐述 IF 实验步骤中的关键步骤、介绍抗体性能和对照设计方面的重要概念，并提供支持性数据来论证我们提供的建议。

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染色质免疫沉淀（ChIP）成功指南 

染色质免疫沉淀 (ChIP) 被用于检测胞核天然染色质结构内的蛋白质与 DNA 之间的相互作用。ChIP 实验首先需要将细胞固定，使蛋白质与 DNA 相互作用被交联固定。然后将染色质打断为片段，使用抗体对目的蛋白以及与其结合的 DNA 进行免疫沉淀 (IP) 。最后，解交联，对沉淀 DNA 进 行纯化。纯化的 DNA 可进行进一步的分析，如标准或定量 PCR（qPCR、ChIP-qPCR）或下一代测序（NGS、ChIP-seq）。

这些实验对染色质的完整性、抗原表位的稳定性以及免疫沉淀抗体的特异性较为敏感。当所研究的蛋白质与 DNA 相互作用呈低丰度和/或低稳定 性时，这些影响变得更为明显。

高丰度、稳定的相互作用（如组蛋白与 DNA 之间相互作用）常易于检测，即使信噪比低于预期，仍可能检测到这些相互作用。相反，如果实验操 作流程未能保持蛋白质和 DNA 的完整性或者针对目的蛋白的抗体是较低亲和力，低丰度或较不稳定的相互作用（如转录因子，辅因子）可能会很 难进行检测。经过优化的 ChIP 实验操作流程将保护特定信号、降低背景信号，并让感兴趣的相互作用显现出来。

本指南重点阐述了基于超声法和酶解法的两种 ChIP 实验操作流程中的关键步骤，并展示了抗体验证和流程调整对最终实验结果的影响。

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免疫组化（IHC）成功指南

免疫组化（IHC）是一种常用于对正常和病变组织进行形态学表征的技术。在保持原组织成分、细胞特征以及结构的情况下，该 方法利用抗体检测并分析蛋白表达。化学固定常用中性福尔马林缓冲液（NBF）或甲醛将细胞内以及细胞间分子相互作用固定在原位。组织样本在被切成切片以及装入载玻片以供分析之前，可在石蜡中包埋或在低温溶液中进行冷冻保存。针对不同的样 本或检测靶标，有不同的组织收集、保存和固定方法。

IHC 通过特异性抗体结合来识别生物样本中蛋白质是否存在以及表达方式。抗体与其靶蛋白表位的精确结合可检测蛋白质中具 有高度特异性的氨基酸序列。抗体也可以检测发生在蛋白质的特定氨基酸序列或基序上的特定翻译后修饰（PTM）。磷酸化特异 性抗体已用于确定特定信号通路分子以及研究在不同的生物学背景下磷酸化事件中的变化。一些针对其他 PTM（如乙酰化和甲 基化）的特异性抗体也已被研发出来，这使得研究人员能够研究各种生物学过程。

在 Cell Signaling Technology（CST），专门负责 IHC 应用的科学家检测了大量的抗体，只有其中最适合应用于 IHC 的抗体才 会被推荐使用。这些抗体也在 Leica BOND RX 上进行了同样严格的验证和优化，以确保那些进行自动化 IHC 检测的科学家 所获得的数据质量。此外，我们的科学家还研发并测试了可增强抗原检测、提高 IHC 实验流程效率的 IHC 辅助试剂。我们对这 些 IHC 实验步骤进行了十几年的优化，并在 CST 自己的实验室中常规应用这些步骤。您可以查看本指南的第 12 和 13 页或进行 在线查询。遵循这些操作步骤，您可以获得可靠的结果。

在此，我们将重点介绍 IHC 实验流程的关键步骤，并提供数据来支持和解释我们在实验过程中所提的建议。此外，我们也将 讨论在 IHC 实验过程中使用经充分验证的抗体的重要性，并提供使用石蜡包埋进行细胞团块样本制备以及手动或使用 Leica BOND RX 进行免疫组化染色的通用实验步骤。最后，本指南列出了 CST 科学家内部常用且最适合与我们的抗体配套使用的 IHC 辅助试剂。

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信号转导流式细胞术

流式细胞术可通过独特的方式快速分析多个靶点，包括异质细胞群中的蛋白表达水平和胞内信号传导。因此，您可以 使用这项技术来获得对正常和病理状态下生物过程的机理的深刻见解。

Cell Signaling Technolog (CST®) 作为一家优质细胞信号传导分析抗体供应商，提供多种流式抗体和试剂，同时提供 胞内信号传导通路定量分析和表型分析。

我们拥有抗体设计、偶联和流式细胞术方面的专业知识，能够开发和验证流式细胞术实验中您所使用的抗体，确保您 能够放心地使用我们的抗体。同时，开发和验证我司流式产品的研究人员也会提供技术支持，确保您成功开展实验。

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